原标题：质粒构建以及必需要分外留意的事项
1.载体构建
载体构建(vectorconstruction)：载体构建是分子生物学研讨常用的手法之一。最重要的包括已有载体多克隆位点（MCS）的改造和已有载体启动子、增强子、挑选符号等功能元件的改造。是为把DNA分子运送到受体细胞中去，有必要寻觅一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样仿制的运载体。抱负的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。载体构建便是构建含外源DNA的质粒。
特色：当给质粒刺进一段外源DNA片段后，它仍然能够进行自我仿制。
2.多克隆位点
多克隆位点（multiple cloning site, MCS），指的是包括数个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头（polylinker），是基因工程中常用到的载体质粒的规范装备序列。MCS上含有多个单一酶切位点，是外源DNA的刺进部位，每个限制性酶切位点通常是仅有的，即它们在一个特定的载体质粒中只呈现一次。不同酶的酶切位点可有堆叠。单一酶切位点便是只要一种特定的酶能够辨认并进行酶切的位点，多克隆位点一般是坐落质粒上的一段序列，这段序列含有很多个酶切位点，但这些酶切位点每一个都被一种酶辨认并酶切。
3.质粒构建
（1）质粒构建原理
质粒构建是分子生物学研讨中最常用的试验技能。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA衔接酶和其他润饰酶的作用，分别对意图基因和载体DNA进行恰当切开和润饰后，将二者衔接在一起，再导入宿主细胞，完成意图基因在宿主细胞内的正确表达。
（2）质粒构建办法
质粒构建办法多样，惯例的T4衔接酶，下面就介绍下T4衔接酶构建质粒办法，T4衔接酶可用于平结尾也可用于粘性结尾衔接，但一般引荐适用黏性结尾。
（3）质粒载体的制备
质粒载体的制备既能够再一次进行挑选单酶切也能够再一次进行挑选双酶切，一般引荐运用双酶切。其实意图就只要一个，尽量使载体的结尾具有特异性，避免自连。
4.一般意图基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的挑选要考虑到：
（1）挑选质粒上两个酶切位点的间隔不该小于太小（>10bp），不然影响限制性内切酶对切点的辨认，不利于空载体的双酶切。
（2）一般意图基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的挑选要考虑到：意图基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然判定阳性重组子双酶切时会将意图基因堵截）。
（3）试验后继运用的一切载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。而且要确保在载体上的刺进方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要从头规划引物，以引入新的酶切位点）。
（4）尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较廉价）。
（5）两个酶切点至少隔上3个碱基。
（6）两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），不然作用相当于单酶切。
（7）最好运用酶切效率高的酶。
（8）最好运用双酶切有一起buffer的酶。
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